Advanced genetic engineering techniques for producing recombinant extreme biocatalysts

Heterogeneous gene expression seems a common and simple technique since hundreds of genes have been overexpressed in Escherichia coli. However, many interesting and important tests are stopped at protein preparation from a target gene, and the industrial applications of extreme biocatalysts are hindered by the high costs of enzyme production. A gene expression system of E. coli, pHsh, was constructed to enhance the production of thermostable enzymes by using the consensus promoter of heat shock (Hsh) proteins. The target gene in pHsh is under control of an alternative sigma factor, σ32, and its expression is induced by a temperature up-shift. The presence of pHsh increases σ32 concentration in E. coli cells, which could strengthen the transcription of heat shock chaperons. pHsh exhibits advantages in allowing healthful growth of recombinant cells, increasing production of target protein, and decreasing inclusion body formation. Based on pHsh system and mediated by thermostable DNA ligase, in situ error-prone PCR technique has been developed to perform directed evolution in a step of PCR amplification and plate selection. Combining the techniques of pHsh expression, site-directed mutagenesis, and directed evolution, we have modified genes coding for extreme biocatalysts with desired properties, e.g. the genes encoding extremely thermostable xylanase and laccase have been improved, and enzymes can be efficiently produced for biobleaching pulp at high temperatures. These advanced techniques will enhance the production and application of industrial enzymes.